产品详情
【产品简介】
Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490 nm, Em=515 nm）。通过在传统Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。Calcein-AM本身不发荧光，进入细胞后被活细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM仅能标记活细胞。
碘化丙啶（PI）不能穿过活细胞的完整细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序区域到达细胞核，嵌入细胞DNA双螺旋产生红色荧光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此PI仅对死细胞染色。本试剂盒利用Calcein-AM和PI的双重染料，进行活细胞和死细胞的双重染色标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。
【产品特点】
1. 双重染色：Calcein-AM标记活细胞（绿色荧光），PI标记死细胞（红色荧光），一次染色即可区分；
2. 细胞毒性极低：Calcein-AM是最适合用于活细胞染色的荧光探针，不抑制细胞增殖和淋巴细胞趋化性；
3. 操作简便：染色步骤简单，1小时内即可完成检测；
4. 灵活检测：适用于荧光显微镜和流式细胞仪两种检测平台。
【储存条件】
- 保存：-20℃ 避光干燥保存，有效期 12 个月。
- 运输：干冰或冰袋运输，收货后立即 -20℃ 存放。
【产品组成】
组分 | 500T规格 | 保存条件 |
Calcein-AM Solution（2 mM） | 50 μL | -20℃避光干燥保存 |
PI Solution（1.5 mM） | 150 μL | -20℃避光干燥保存 |
10× Assay Buffer | 50 mL | -20℃（经常使用可2-8℃） |
【使用说明】
1、工作液前处理
（1）将10× Assay Buffer从冰箱取出，用去离子水按 1:9 稀释（如5 mL 10× Buffer + 45 mL 去离子水），得到1× Assay Buffer。
（2） Calcein-AM稳定性受温度影响较大，建议染色液现配现用，当天用完。
2、细胞样品准备
悬浮细胞：
收集细胞至离心管，450×g 离心5分钟，弃上清。用1× Assay Buffer洗涤细胞2次，每次450×g离心5分钟，去除残留酯酶。
贴壁细胞：
经0.25%胰酶-EDTA消化后收集细胞，用1× Assay Buffer洗涤细胞2次，每次450×g离心5分钟，去除胰酶及残留酯酶。
> 注：培养基中的血清含有酯酶，会分解Calcein-AM导致背景升高，需充分洗涤去除残留酯酶。
3、染色步骤
（1） 用1× Assay Buffer重悬细胞沉淀，调整细胞密度至 1×10⁵-1×10⁶ cells/mL。
（2）每1 mL细胞悬液加入 1-2 μL Calcein-AM原液（2 mM） （终浓度2-4 μM），吹打混匀，37℃ 避光孵育20-25分钟。
（3）加入 3-5 μL PI原液（1.5 mM）（终浓度4.5-7.5 μM），室温避光染色 5分钟。
（4） 孵育后，450×g 离心5分钟，去除染色液。
（5）用1× PBS清洗细胞一次，离心后用1× PBS重悬细胞。
（6）取3-5 μL滴于洁净载玻片上，盖玻片压片后荧光镜检。
> 注：
> - 细胞进行荧光染色时建议全程避光。
> - 染色后建议1小时内完成检测。
> - 贴壁细胞也可不消化，直接在培养板中原位染色。
4、检测
- 荧光显微镜：使用 490±10 nm 激发滤片，可同时检测活细胞（绿色荧光）和死细胞（红色荧光）；使用 545 nm 激发滤片仅能观察到死细胞（红色荧光）。
- 荧光酶标仪：可在合适的滤片下进行定量检测。
【结果分析】
细胞状态 | Calcein-AM | PI | 荧光信号 |
活细胞 | +（被酯酶水解） | - | 绿色荧光（Ex/Em:490/515 nm） |
死细胞 | -（缺乏酯酶） | + | 红色荧光（Ex/Em:535/617 nm） |
【常见问题】
1. 适用于哪些细胞类型： 适用于含酯酶活性的动物细胞；植物和细菌细胞因含细胞壁，Calcein-AM无法进入，不适用。
2. 不同细胞可用相同浓度染色： 不建议。不同细胞系最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验确定最适浓度。
3. Calcein-AM对细胞有毒性： 细胞毒性极低，不影响细胞增殖和淋巴细胞趋化性。
4. 染色工作液为什么必须现配现用： Calcein-AM稳定性差，配制后会逐渐降解，必须当天用完。
5. 为什么需用Assay Buffer洗涤细胞： 培养基中血清含酯酶，会分解Calcein-AM导致背景升高，需充分洗涤去除。
6. 贴壁细胞必须消化后染色：也可原位染色：去除培养基，用1×Assay Buffer浸洗2次后直接加染色液。
【注意事项】
1. 仅限科研使用，不得用于临床诊断或治疗。
2. Calcein-AM和PI均为光敏物质，操作时注意避光。
3. PI有一定致癌性，操作时请戴手套，若接触皮肤立即用大量自来水清洗。
4. 请勿反复冻融Calcein-AM和PI组分，建议首次使用时分装保存。
5. 染色工作液必须现配现用，当天用完。
6. 染色后建议1小时内完成检测。
7. 若镜检荧光亮度过强，可将Calcein-AM稀释比例调整至1:500-1:2000。
8. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。