Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒

【产品简介】

Augene Tech 的Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒用于细胞凋亡的快速检测。在细胞凋亡早期，质膜内侧的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）会外翻至细胞膜表面；而在凋亡的中后期，一些较大分子的化合物，如碘化丙啶（Propidium Iodide，PI，一种DNA结合染料），可进入细胞将细胞核染上红色荧光。

Annexin V是一种Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸特异性结合。本试剂盒采用绿色荧光FITC标记的Annexin V作为检测磷脂酰丝氨酸的探针，配合碘化丙啶（PI），通过使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备，可以快速检测细胞凋亡。因此将Annexin V-FITC与PI进行共染，就可以区分不同凋亡时期的细胞。在双色流式细胞仪散点图上，Annexin V-FITC与PI双阴性为正常细胞，Annexin V-FITC阳性、PI阴性为早期凋亡细胞，Annexin V-FITC与PI双阳性为晚期凋亡细胞或坏死细胞。

【产品特点】

1.快速检测：可在1小时内完成流式检测；

2.准确区分：可区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞；

3.灵活应用：适用于流式细胞仪或荧光显微镜检测；

4.双色标记：FITC标记Annexin V呈绿色荧光，PI呈红色荧光。

【储存条件】

-保存：避光保存于2~8℃，保质期12个月。Annexin V-FITC和PI Solution需避光保存。

-运输：冰袋运输。

-注意事项：使用后请及时放回2~8℃冰箱，避免长时间室温放置。

【产品组成】

- Annexin V-FITC

- PI Solution

- 10×Binding Buffer

【使用说明】

 一、样本染色——悬浮细胞

1. 离心收集所需细胞（1500 rpm，5 min）；

2. 加入预冷的PBS轻柔重悬细胞，离心收集细胞，共洗涤两次；

3. 用去离子水将10×Binding Buffer稀释至1×Binding Buffer，再用1×Binding Buffer重悬细胞，调整细胞浓度为1-5×10⁶ cells/mL；

4.流式检测需设置三个对照样品来调节电压和补偿：

   -空白管：仅用1×Binding Buffer重悬的细胞，以评估自身荧光水平，并调整仪器电压；

   -单染管：分别用Annexin V-FITC或碘化丙啶（PI）染色，用于调节荧光通道的补偿。

5. 吸取100 μL细胞悬液（细胞总数为1-5×10⁵ cells）至一新EP管中，加入5 μL Annexin V-FITC，轻柔混匀；再加入5 μL碘化丙啶（PI），轻柔混匀，室温避光孵育10~15 min；

6. 加入400 μL 1×Binding Buffer，轻柔混匀。染色后样品尽量在1 h内用流式细胞仪检测。

 二、样本染色——贴壁细胞

1. 将细胞培养液吸出至一新离心管内，接着用预冷的PBS轻柔洗涤贴壁细胞一次。加入可以覆盖贴壁细胞的胰酶消化液，轻摇使胰酶与细胞充分接触，室温消化适当时间，轻轻吹打可以使贴壁细胞脱落下来即可；

2. 在细胞中加入上一步骤收集的细胞培养液，稍混匀，转移至离心管内，离心（1500 rpm，5 min），弃上清，收集细胞；

3. 加入预冷的PBS轻柔重悬细胞，离心收集细胞，共洗涤两次；

4. 用去离子水将10×Binding Buffer稀释至1×Binding Buffer，再用1×Binding Buffer重悬细胞，调整细胞浓度为1-5×10⁶ cells/mL；

5.流式检测需设置三个对照样品来调节电压和补偿（同上）；

6. 吸取100 μL细胞悬液（细胞总数为1-5×10⁵ cells）至一新EP管中，加入5 μL Annexin V-FITC，轻柔混匀；再加入5 μL碘化丙啶（PI），轻柔混匀，室温避光孵育10~15 min；

7. 加入400 μL 1×Binding Buffer，轻柔混匀。染色后样品尽量在1 h内用流式细胞仪

 【样品分析】

 1. 流式细胞仪分析

-FITC：使用FL1通道（Ex/Em = 490/525 nm）的流式细胞仪分析细胞；

-PI：PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm，最大发射波长为615 nm，PI的红色荧光在FL2或FL3通道检测，建议使用FL3。

 2. 荧光显微镜分析

滴一滴染色后的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞，荧光显微镜下观察。在荧光显微镜下用双色滤光片观察：Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。

>注：对于贴壁细胞，可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞。

 【常见问题与解决方案】

 1. 假阳性

未经凋亡诱导的细胞（阴性对照）染色后Annexin V-FITC/PI双阳性比例过高，其原因可能是细胞本身活力低。因此建议用台盼蓝染色计算细胞活力，阴性对照台盼蓝阳性的细胞比例应小于5%。若细胞活力低，建议换用其他细胞或重新复苏细胞，新复苏的细胞应传代1-2代以后进行实验。

 2. Annexin V-FITC染色失败或者阳性率偏低

首先需要确定实验中所用的凋亡诱导剂是否能产生凋亡。可通过设立阳性对照组来确定（诱导效果确定的阳性药物处理细胞）。Annexin V-FITC染色失败，最常见的操作原因是贴壁细胞消化不当。Annexin V跟PS的结合需要Ca²⁺，Binding Buffer中含有Ca²⁺，含EDTA的胰酶消化会影响染色。

 【注意事项】

1.仅限科研使用，不得用于临床诊断或治疗；

2. 需设置空白管和单染管用于流式细胞仪电压和补偿调节；

3. 贴壁细胞消化时避免使用含EDTA的胰酶，以免影响Annexin V与PS的结合；

4. 染色后样品尽量在1小时内 完成检测；

5. 操作过程需避光，Annexin V-FITC和PI均为光敏物质；

6. 整个操作过程动作应轻柔，避免损伤细胞；

7. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。