产品详情
【产品简介】
Augene Tech 的Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒用于细胞凋亡的快速检测。在细胞凋亡早期，质膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）外翻至细胞膜表面；Annexin V是一种Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS特异性结合。本试剂盒采用APC标记的Annexin V作为探针，配合7-AAD（7-氨基放线菌素D）核酸染料，通过流式细胞仪或荧光显微镜检测细胞凋亡。7-AAD不能透过完整细胞膜，但可进入死细胞或晚期凋亡细胞，与DNA结合发出红色荧光。7-AAD的发射光谱较PI窄，且发射波长更长，对其它检测通道的干扰更小，是多色荧光分析中PI的最佳替代品。双染后可将正常细胞（Annexin V-APC⁻/7-AAD⁻）、早期凋亡细胞（Annexin V-APC⁺/7-AAD⁻）和晚期凋亡/坏死细胞（Annexin V-APC⁺/7-AAD⁺）区分开来。
【产品特点】
1. 多色兼容：7-AAD发射光谱窄、波长长，对其它通道干扰小，适合多色流式分析；
2. 快速检测：可在1小时内完成流式检测；
3. 准确区分：可区分正常、早期凋亡及晚期凋亡/坏死细胞；
4. 灵活应用：适用于流式细胞仪或荧光显微镜检测。
【储存条件】
- 保存：避光保存于2~8℃，保质期 12个月。Annexin V-APC和7-AAD Solution需避光保存。
- 运输：冰袋运输。
- 注意事项：使用后请及时放回2~8℃冰箱，避免长时间室温放置。
【产品组成】
- Annexin V-FITC
- PI Solution
- 10×Binding Buffer
> 具体规格及数量请参见产品标签。
【使用说明】
一、样本染色——悬浮细胞
1. 离心收集所需细胞（1500 rpm，5 min）；
2. 加入预冷的PBS轻柔重悬细胞，离心收集细胞，共洗涤两次；
3. 用去离子水将10×Binding Buffer稀释至1×Binding Buffer（9份去离子水加1份10×Binding Buffer），再用1×Binding Buffer重悬细胞，调整细胞浓度为1-5×10⁶ cells/mL；
4. 流式检测需设置三个对照样品来调节电压和补偿：
- 空白管：仅用1×Binding Buffer重悬的细胞，以评估自身荧光水平，并调整仪器电压；
- 单染管：分别用Annexin V-APC或7-AAD染色，用于调节荧光通道的补偿。
5. 吸取100 μL细胞悬液（细胞总数为1-5×10⁵ cells）至一新EP管中，加入5 μL Annexin V-APC，轻柔混匀；再加入5 μL 7-AAD，轻柔混匀，室温避光孵育10~15 min；
6. 加入400 μL 1×Binding Buffer，轻柔混匀。染色后样品尽量在1 h内用流式细胞仪检测。
二、样本染色——贴壁细胞
1. 将细胞培养液吸出至一新离心管内，接着用预冷的PBS轻柔洗涤贴壁细胞一次。加入可以覆盖贴壁细胞的胰酶消化液，轻摇使胰酶与细胞充分接触，室温消化适当时间，轻轻吹打可以使贴壁细胞脱落下来即可；
2. 在细胞中加入上一步骤收集的细胞培养液，稍混匀，转移至离心管内，离心（1500 rpm，5 min），弃上清，收集细胞；
3. 加入预冷的PBS轻柔重悬细胞，离心收集细胞，共洗涤两次；
4. 用去离子水将10×Binding Buffer稀释至1×Binding Buffer，再用1×Binding Buffer重悬细胞，调整细胞浓度为1-5×10⁶ cells/mL；
5. 流式检测需设置三个对照样品来调节电压和补偿（同上）；
6. 吸取100 μL细胞悬液（细胞总数为1-5×10⁵ cells）至一新EP管中，加入5 μL Annexin V-APC，轻柔混匀；再加入5 μL 7-AAD，轻柔混匀，室温避光孵育10~15 min；
7. 加入400 μL 1×Binding Buffer，轻柔混匀。染色后样品尽量在1 h内用流式细胞仪检测。
【样品分析】
流式细胞仪分析
用流式细胞仪检测，Annexin V-APC建议使用APC通道（Ex/Em = 651 nm/660 nm）检测；7-AAD可用FL3通道（Ex/Em = 545 nm/650 nm）检测。
荧光显微镜分析（可选）
滴加染色后细胞悬液于载玻片，盖玻片封片，用双色滤光片观察：Annexin V-APC呈远红外/深红色荧光，7-AAD呈红色荧光。
【常见问题与解决方案】
1. 假阳性
未经凋亡诱导的细胞（阴性对照）染色后Annexin V-APC/7-AAD双阳性比例过高，其原因可能是细胞本身活力低。建议用台盼蓝染色计算细胞活力，阴性对照组台盼蓝阳性的细胞比例应小于5%。若细胞活力低，建议换用其他细胞或重新复苏细胞，新复苏的细胞应传代1-2代以后进行实验。
2. Annexin V-APC染色失败或者阳性率偏低
首先需要确定实验中所用的凋亡诱导剂是否能产生凋亡。可通过设立阳性对照组来确定（诱导效果确定的阳性药物处理细胞）。Annexin V-APC染色失败，最常见的操作原因是贴壁细胞消化不当。Annexin V跟PS的结合需要Ca²⁺，Binding Buffer中含有Ca²⁺，含EDTA的胰酶消化会影响染色。
【注意事项】
1. 仅限科研使用，不得用于临床诊断或治疗；
2. Annexin V-APC和7-AAD染色前，不能用破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜；
3. 整个操作过程动作要尽量轻柔，请勿用力吹打细胞，避免对细胞造成机械性损伤；
4. 对于贴壁细胞，消化过程需注意：
- 贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞合并染色；
- 胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，导致7-AAD摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上PS与Annexin V-APC的结合；
- 尽量使用不含EDTA的胰酶，EDTA会影响Annexin V与PS的结合；如使用含EDTA的胰酶消化细胞，需要在染色之前用PBS洗涤细胞两次以去除EDTA；
5. 如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果；
6. Annexin V-APC和7-AAD是光敏物质，操作时请注意避光；
7. 染色后样品尽量在1小时内完成检测；
8. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。