产品详情
【产品简介】
Augene Tech 的 Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒，适用于流式细胞仪或荧光显微镜快速检测细胞凋亡情况。在正常活细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜的内侧；在细胞凋亡早期，PS 从细胞膜内侧翻转到外侧，暴露在细胞外环境中。Annexin V 是一种 Ca²⁺ 依赖性磷脂结合蛋白，与 PS 有高度亲和力，可特异性结合凋亡早期细胞膜外侧的 PS。将 Annexin V 以 FITC 荧光素标记后，可作为探针检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一种核酸染料，不能穿透完整细胞膜，但可穿透凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜，使细胞核染红。将 Annexin V-FITC 与 PI 匹配使用，可将正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞区分开来。
【产品特点】
1. 快速简便：染色后 1 小时内即可完成流式检测；
2. 准确可靠：能准确区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞；
3. 灵活检测：适用于流式细胞仪或荧光显微镜检测；
4. 双标区分：FITC 绿色荧光标记早期凋亡细胞，PI 红色荧光标记晚期凋亡/坏死细胞；
5. 兼容性好：改进型高纯度 FITC 染料在红色通道（690 nm）无发射光，荧光相互干扰更小。
【储存条件】
- 保存：2-8℃ 避光保存，有效期 12 个月。
- 运输：冰袋运输，收货后立即 2-8℃ 存放。
【产品组成】
组分 | 100T规格 | 保存条件 |
Annexin V-FITC | 500 μL | 2-8℃避光保存 |
Propidium Iodide（PI） | 500 μL | 2-8℃避光保存 |
Binding Buffer（10×） | 30 mL | 2-8℃（长期-20℃） |
> 使用前请仔细阅读说明书，本产品试剂浓度较同类产品有所不同。
【使用说明】
1、Binding Buffer（1×）配制
- 用去离子水将 10× Binding Buffer 按 1:9稀释（如 3 mL 10× Buffer + 27 mL 去离子水）。
- 配制后室温或 4℃ 保存，建议现配现用。
2、细胞样品准备
贴壁细胞：
（1） 小心收集细胞培养液至离心管内备用。
（2） 用 不含 EDTA 的胰酶消化细胞，至细胞可被轻轻吹打下来时，加入前面收集的培养液终止消化。
（3）吹打下所有贴壁细胞，轻轻吹散，1000 rpm（或 300×g）离心 5 分钟，沉淀细胞。
（4）小心吸除上清（可残留约 50 μL 培养液，避免吸走细胞），加入约 1 mL 4℃ 预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀，小心吸除上清。
悬浮细胞：
（1） 收集细胞，1000 rpm（或 300×g）离心 5 分钟，沉淀细胞。
（2）小心吸除上清，加入约 1 mL 4℃ 预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀，小心吸除上清。
注：EDTA 会螯合 Ca²⁺，影响 Annexin V 结合，请务必使用不含 EDTA 的胰酶。整个操作过程动作要轻柔，勿用力吹打细胞。
3、染色
（1） 用 1× Binding Buffer重悬细胞，调整细胞密度至 1-5×10⁵ cells/mL。
（2） 取 100 μL细胞悬液（含 1-5×10⁵ 个细胞）至流式管中。
（3） 加入 5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育 5-15 分钟。
（4） 加入 5 μL PI 染液，轻轻混匀。
（5）加入 400 μL PBS，立即进行流式细胞仪或荧光显微镜检测。
> 注：PI 加入后应尽快上机检测（1 小时内），时间延长会加大误差。
4、荧光显微镜检测（可选）
（1） 将染色后的细胞混合液离心，取细胞沉淀涂片。
（2） 在荧光显微镜下用双色滤光片观察：Annexin V-FITC 呈绿色荧光，PI 呈红色荧光。
【实验设计】
管别 | 细胞 | Annexin V-FITC | PI | 用途 |
空白管 | 阴性对照 | 一 | 一 | 调节电压 |
单染管 | 阳性对照 | + | 一 | 调节FITC通道补偿 |
单染管 | 阳性对照 | 一 | + | 调节PI通道补偿 |
检测管 | 处理细胞 | + | + | 获取流式数据 |
> 建议：每次检测需同时设置 Annexin V-FITC 单阳性管和 PI 单阳性管，用于确定荧光补偿数值及十字象限门的位置。
【结果分析】
流式细胞仪分析
（1）FITC：最大激发 488 nm，最大发射 525 nm，绿色荧光在 FL1 通道检测。
（2）PI：最大激发 535 nm，最大发射 615 nm，红色荧光在 FL2 或 FL3 通道检测。
用软件（如 FlowJo、CellQuest）绘制双色散点图，FITC 为横坐标，PI 为纵坐标：
细胞分群 | AnnexinV-FITC | PI | 说明 |
活细胞 | - | - | 仅很低强度背景荧光 |
早期凋亡细胞 | + | - | 较强绿色荧光 |
晚期凋亡细胞 | + | + | 绿色和红色荧光双染 |
坏死细胞 | - | + | 仅红色荧光 |
【常见问题】
1. 贴壁细胞凋亡率偏高：使用不含EDTA的胰酶，缩短消化时间，轻柔吹打，避免机械损伤。
2. PI阳性率随时间升高：先加Annexin V孵育5-15min，再加PI后立即上机，1h内完成检测。
3. 细胞分群不明显：控制细胞密度1-5×10⁵/mL，染料用量按说明书，孵育5-15min。
4. 坏死细胞比例过高：降低药物浓度或缩短处理时间；确保细胞处于对数生长期。
5. 荧光补偿难调：必须设置空白管、Annexin V单染管、PI单染管进行电压及补偿调节。
【注意事项】
1. 仅限科研使用，不得用于临床诊断或治疗。
2. Annexin V-FITC 和 PI 均为光敏物质，操作时注意避光。
3. PI 有毒，能通过皮肤吸收，操作时请戴手套。
4. 请勿冷冻Annexin V-FITC 和 PI 组分。
5. 必须使用 不含 EDTA 的胰酶（EDTA 螯合 Ca²⁺，影响 Annexin V 结合）。
6. 整个操作过程动作轻柔，勿用力吹打细胞。
7. 染色后 1 小时内完成流式检测。
8. 洗涤细胞时最后一遍尽量弃净上清，以免 PBS 残留影响结果。
9. 本试剂盒不推荐用于组织样本。
10. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。