Mouse Neutrophil Isolation Kit,AGCC-12109

产品介绍

本试剂盒采用免疫磁珠阴性分离原理，从小鼠骨髓、脾脏或外周血单细胞悬液中快速、高效地分离高纯度、未经标记的小鼠中性粒细胞。

试剂盒中包含生物素标记的抗体混合物，针对性地结合非目标细胞（如T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、红细胞前体等）表面抗原。随后加入链霉亲和素标记的磁珠，这些磁珠会与结合在非目标细胞上的生物素抗体结合。将细胞悬液置于磁场中时，被磁珠标记的非目标细胞被滞留，而未被标记的中性粒细胞则游离出来，通过简单的倾倒或收集即可获得高纯度的目的细胞。

产品特点

-   高纯度与高活率：分离过程温和，无需在目标细胞上标记抗体或磁珠，细胞未被活化，活力极高。骨髓样本纯度通常可达 88.7% - 95% 以上，血液样本纯度可达 93.7% 以上。

-   操作简便、快速：无需使用分离柱（具体取决于所选品牌和磁极类型），配合磁力架使用，整个分离流程通常可在 30-50分钟 内完成。

-   细胞功能完好：分离得到的中性粒细胞表面无抗体和磁珠粘连，即用型，特别适用于对细胞状态要求高的下游功能实验，如趋化、吞噬、NETs形成、呼吸爆发等研究。

使用方法 (仅供参考)

注意：所有操作尽可能在无菌、低温（2-8°C）条件下进行，以保持细胞活性和功能。

 1. 样本制备

1.  获取单细胞悬液：

    -   骨髓：冲洗小鼠股骨和胫骨骨髓腔，收集细胞。

    -   脾脏：在70 µm滤网上研磨脾脏，收集细胞。

    -   外周血：采集抗凝外周血。

2.  去除红细胞 (可选但推荐)：

    -   离心弃上清，加入适量红细胞裂解液 (如ACK)，室温孵育 3-5分钟。

    -   加入过量PBS终止裂解，300×g离心5分钟，弃上清。

3.  过滤与计数：

    -   用预冷的分选缓冲液重悬细胞，通过 70 µm细胞滤网 去除细胞团块。

    -   计数并调整细胞浓度为 1×10^8 细胞/mL (使用预冷的分选缓冲液)。

 2. 磁性标记

1.  加入抗体混合物：

    -   取100 µL 细胞悬液 (即1×10^7个细胞) 置于无菌流式管或离心管底部。

    -   加入 2 µL (或10 µL，视具体试剂盒说明书而定) 生物素标记抗体混合物。涡旋混匀。

    -   孵育：2-8°C 孵育 10-15分钟。

2.  洗涤：

    -   加入1-2 mL 分选缓冲液，300×g 离心5分钟，弃上清。

3.  加入磁珠：

    -   用100 µL 分选缓冲液重悬细胞。

    -   重悬磁珠：涡旋振荡链霉亲和素磁珠 5-10秒，使其完全重悬。

    -   加入 20 µL (或10 µL) 链霉亲和素磁珠。混匀。

    -   孵育：2-8°C 孵育 10-15分钟。

4.  洗涤 (可选)：

    -   部分说明书建议此步直接上柱分离，部分建议洗涤后重悬。若按无柱法，通常此步无需洗涤直接上磁极，具体请严格参照您购买品牌的说明书。

    -   如需洗涤：加入1-2 mL缓冲液，300×g离心5分钟，弃上清。

 3. 磁性分离 (以无柱法为例)

1.  重悬：

    -   将细胞重悬于 2.5 mL 分选缓冲液中，用移液器轻柔吹打混匀。

2.  上磁极：

    -   将流式管放入磁力架中，静置 5分钟。

3.  收集目的细胞：

    -   保持流式管在磁力架内，将上清液小心地倒入一个新的无菌离心管中。此上清即为富集的中性粒细胞，切勿丢弃。

    -   (可选为提高纯度) 可将收集到的细胞悬液再次放入磁力架，重复静置5分钟，再次收集上清。

4.  离心收集：

    -   将收集到的细胞悬液300×g离心5分钟，弃上清，获得纯净的中性粒细胞。

5.  重悬备用：

    -   根据下游实验要求，使用合适的培养基或缓冲液重悬细胞，置于冰上待用。

 4. (备选方案) 柱式分离法

如果使用分选柱 (如LS Column) 进行分离，请参考以下步骤：

1.  完成上述“磁性标记”步骤后，用至少 500 µL 缓冲液重悬细胞。

2.  将分选柱置于磁场中，用 3 mL 缓冲液润洗柱子。

3.  将细胞悬液通过滤网加入分选柱，收集流出的液体 (此为中性粒细胞)。

4.  用 3 mL 缓冲液清洗柱子 3次，合并流出的液体。

5.  收集的细胞悬液离心，弃上清，获得纯净中性粒细胞。

注意事项

1.  起始样本要求：必须使用新鲜样本（最好在2-4小时内处理）。中性粒细胞非常脆弱，样本放置过久会导致自发凋亡和细胞活力急剧下降。

2.  缓冲液要求：整个分选过程中，缓冲液必须 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ ，并含有 EDTA，以防止细胞激活和聚集。

3.  避免气泡和剧烈震荡：混匀细胞时动作要轻柔，避免产生气泡堵塞柱子或影响磁珠结合。

4.  温度控制：所有孵育步骤必须在 2-8°C (冰上或冰箱) 进行，低温可防止中性粒细胞非特异性吞噬抗体-磁珠复合物，并减少细胞活化。

5.  去除细胞团块：上柱或上磁极前务必使用 70 µm滤网 过滤，细胞团块会严重影响纯度。

6.  死细胞影响：如果样本中死细胞过多 (>20%)，会大大降低纯度，建议分离前使用死细胞去除试剂盒。

常见问题解答

Q1: 分离得到的中性粒细胞纯度低 (<85%)，混杂其他细胞？

A1:

    -   可能原因1：抗体混合物或磁珠用量不足。 请确认是否按照说明书推荐的比例（如 1×10^7 细胞加 2 µL抗体）加入试剂，特别是处理大量细胞时。

    -   可能原因2：孵育时间不够或温度过高。 确保在 4°C 孵育足时 (10-15分钟)。

    -   可能原因3：未去除红细胞或死细胞过多。 红细胞碎片和非特异性吸附会干扰分离。建议使用红细胞裂解液。

Q2: 细胞产率非常低 (收获的细胞数量远少于预期)？

A2:

    -   可能原因1：细胞状态差。 样本处理不及时或放置过久，中性粒细胞已凋亡。务必使用新鲜骨髓/血液。

    -   可能原因2：细胞损失在洗涤步骤。 离心力不足 (推荐300×g) 或离心后倾倒上清时动作过猛导致细胞丢失。

    -   可能原因3：目的细胞被错误标记。 检查是否混用了阳选试剂盒，或Fc受体未封闭导致非特异性结合。

Q3: 磁珠没有被磁极吸住，或者流速特别慢？

A3:

    -   无柱法： 如果磁珠不被吸住，检查磁力架是否适配试管类型，或静置时间是否足够 (推荐5分钟)。如果液体中有可见黑色团块，说明磁珠结合了细胞但未被吸住，可能是磁极强度不够。

    -   柱式法：流速慢 通常是因为细胞团块或蛋白沉淀堵塞柱子。上样前务必通过 30 µm 滤网 过滤。

Q4: 分离后的中性粒细胞能否直接用于功能实验？

A4: 完全可以，且这是本试剂盒的优势。 由于采用的是阴性分选，中性粒细胞表面未结合任何抗体或磁珠，细胞未被活化，非常适合趋化、ROS检测、吞噬、NETs形成等功能性研究。

Q5: 磁珠需要去除吗？

A5: 不需要。 阴性分选的中性粒细胞本身不结合磁珠。而被磁珠标记的非目标细胞会留在磁场中，不会出现在最终的目的细胞产品里。

产品声明
本产品仅限于科研，如需储存珍贵样本，请自行小规模尝试后大批量实验，产品售后仅限产品本身，无其他任何连带责任，请须知。

本产品仅供研究使用，不适用于临床诊断或治疗。